植物免疫沉淀試劑盒是用于研究植物體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用或蛋白質(zhì)-DNA相互作用的重要工具，應(yīng)用介紹：
 

　　研究蛋白質(zhì)相互作用：如確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用，可用于磷酸化位點(diǎn)分析、激酶活性分析、乙?；稽c(diǎn)發(fā)現(xiàn)與鑒定等研究分析。
 

　　研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用：用于葡萄轉(zhuǎn)錄因子VlbZIP30抗旱功能及其調(diào)控機(jī)理研究等。從葡萄品種中克隆到VlbZIP30，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物，研究VlbZIP30對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的功能及其調(diào)控機(jī)制。EMSA、雙熒光素酶活性分析和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VlbZIP30可以直接特異性結(jié)合木質(zhì)素生物合成基因和干旱響應(yīng)基因啟動(dòng)子上的G-box順式作用元件，以激活其表達(dá)，最終賦予轉(zhuǎn)基因葡萄的抗旱性。
 

　　操作流程(以植物染色質(zhì)免疫沉淀分析試劑盒為例)
 

　　準(zhǔn)備溶液：如90%乙醇、70%乙醇、37%甲醛、2M甘氨酸溶液、14.3M β-巰基乙醇、1X TE緩沖液(pH 8.0)等(不提供，可單買)，并確保所有的緩沖液是清澈的。
 

　　抗體結(jié)合在微孔板中
 

　　預(yù)估實(shí)驗(yàn)所需聯(lián)管的數(shù)量，小心確保從板架上移走不需要的聯(lián)管并把他們放回袋子(輕輕合上袋子并儲(chǔ)存在4°C)。使用150 μl 的CP1清洗孔一次。
 

　　每孔添加100 μl的CP2，并依次加入如下抗體：加1 μl的Normal-Mouse IgG作為陰性對(duì)照和加1 μl的Anti-Dimethyl H3-K9作為陽(yáng)性對(duì)照，并添加2 - 3 μg自己感興趣的抗體到樣本孔。
 

　　使用保鮮膜(封板膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發(fā)并在室溫孵育60 - 90分鐘。孵育完后，移走孵育過(guò)的抗體溶液并吸取150 μl的CP2用移液器來(lái)回清洗孔三遍。同時(shí)，從細(xì)胞中制備DNA片段。
 

　　收集組織和在活的有機(jī)體內(nèi)交聯(lián)(以單層或附著細(xì)胞為例)
 

　　從生長(zhǎng)在土壤中或在50 ml的試管內(nèi)，收集0.8 - 1g的植物組織(花，葉片和幼種)。
 

　　使用20ml的去離子水輕柔地沖洗組織兩遍。
 

　　在圓錐管(被甲醛浸泡的組織)的頂端填滿50 ml并使用尼龍紗布保證組織的滲入在真空滲入(并有利于清洗步驟)的過(guò)程中。另外，需要使用類似縫衣針的工具在圓錐管蓋上扎些孔，然后將蓋子蓋上。
 

　　在真空泵的附件上，干燥器上真空滲入組織10分鐘。甲醛溶液應(yīng)該煮沸。
 

　　組織裂解和基因組DNA剪切
 

　　添加1.25ml 2M的甘氨酸溶液(終濃度是0.125 M)熄滅交聯(lián)并繼續(xù)使用真空滲入持續(xù)5分鐘。
 

　　移走甲醛并使用20 ml的去離子水沖洗組織兩遍。在漂洗后，盡最大可能移走水。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，交聯(lián)好的組織要么在液氮中冷凍保存或–80°C儲(chǔ)存，要么直接用來(lái)進(jìn)行核染色質(zhì)的提取。
 

　　以1:5的比例(1X CP3C)，使用蒸餾水稀釋CP3C。添加3.5ul的BME到每10ml的1X CP3C。使用液氮研磨組織成精細(xì)粉末。將粉末放入裝有20 ml 1X CP3C的50ml的圓錐管中，然后渦旋并放在冰上。
 

　　過(guò)濾液通過(guò)二層的米拉布流入到50ml的管子中并以轉(zhuǎn)速4000 rpm(1900X g)離心過(guò)濾液20分鐘。
 

　　添加1ul BME到每1ml的CP3D中。移走上清液并在包含BME的1ml CP3D再次懸浮小球。轉(zhuǎn)移再次懸浮的小球到一個(gè)1.5 ml的管子中并在4°C轉(zhuǎn)速12,000 rpm持續(xù)離心10分鐘直至有核產(chǎn)物出現(xiàn)(在這個(gè)階段可以看到有白色的小球)。
 

　　添加1ul BME到每1ml的CP3E中。移走上清液并在包含BME的300 ul CP3E再次懸浮小球。
 

　　添加包含BME的300 ul CP3E到一個(gè)新的1.5 ml的管子中。從第6步中300 ul的緩沖液頂端將小球重懸并在4°C轉(zhuǎn)速14,000 rpm持續(xù)離心45分鐘。
 

　　移走上清液并在包含Protease Inhibitor Cocktail(PIC)(如：每1ml的CP3F添加10ul的PIC)的500 ul CP3F再次重懸染色質(zhì)。通過(guò)聲處理設(shè)備剪切DNA。例如：在冰上對(duì)染色質(zhì)溶液進(jìn)行超聲理五次，每次在工作周期的40%的時(shí)候，15秒；將布蘭森超聲設(shè)備的功率設(shè)置在2。在每次超聲波處理中，需將樣本放置在冰上1分鐘。若有必要，取5ul聲處理過(guò)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。剪切的DNA大小應(yīng)該是在200 - 1000 bp。
 

　　在4°C，轉(zhuǎn)速14,000 rpm，離心細(xì)胞碎片小球10分鐘。
 

　　蛋白/DNA免疫沉淀
 

　　轉(zhuǎn)移清澈的上清液到一個(gè)新的1.5ml的離心管。(在這一步，上清液需儲(chǔ)存在–80°C)按照所需以1:1的比例使用CP4稀釋上清液(如：添加100 μl的CP4到100 μl的上清液)。
 

　　轉(zhuǎn)移5 μl稀釋的上清液到0.5ml瓶中。
 

　　轉(zhuǎn)移100 μl稀釋的上清到每個(gè)包被抗體的孔中。使用保鮮膜(封口膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發(fā)并在搖床(50 - 100 rpm)上室溫(22 - 25°C)孵育60 - 90分鐘。
 

　　轉(zhuǎn)移上清液。使用150 μl的CP1清洗孔六次。允許在搖床(100 rpm)上進(jìn)行2分鐘的清洗。每次使用150 μl的1X TE緩沖液清洗孔(2分鐘)。
 

　　交聯(lián)DNA反轉(zhuǎn)/純化
 

　　添加1μl的蛋白酶K到每40 μl的CP5中并混合。添加40μl包含蛋白酶K的CP5到樣本孔(包含“輸入DNA”瓶)。使用保鮮膜(膠套膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發(fā)并在水浴下65°C水育15分鐘。
 

　　添加40 μl的CP6到樣本孔中，混合，使用保鮮膜(膠套膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發(fā)并在水浴下65°C孵育90分鐘。同樣，添加40μl包含上清液，標(biāo)有“輸入DNA”的CP6到瓶中。
 

　　將離心柱放置在2ml的離心管中。添加150 μl的CP7到樣本中并將混合液轉(zhuǎn)移到柱子中。
 

　　添加200 μl的70%的乙醇到柱子中，以12000rpm離心15秒。
 

　　將柱子放置在一個(gè)新的收集管中。添加200 μl的90%的乙醇到柱子中，以12000rpm離心20秒。
 

　　從收集管轉(zhuǎn)移柱子并棄廢液。將柱子放置在一個(gè)新的收集管中。再次添加200 μl的90%的乙醇到柱子中，以12000rpm離心35秒。
 

　　放置柱子到新的1.5 ml瓶中。直接添加10 - 20 μl的CP8到柱基質(zhì)中并以12000rpm全速離心20秒來(lái)洗脫純化的DNA。現(xiàn)在DNA可以使用了，或在 - 20°C儲(chǔ)存。