細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào)：C1002-50T

存儲(chǔ)條件：-20°C避光，有效期24個(gè)月

產(chǎn)品說(shuō)明：

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium Iodide staining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析。

碘化丙啶(Propidium Iodide，簡(jiǎn)稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。

碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化(DNA fragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA片段在染色過(guò)程中丟失，因此凋亡細(xì)胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強(qiáng)度小于1，在流式檢測(cè)的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細(xì)胞峰。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞對(duì)前向角光散射的能力顯著降低，對(duì)側(cè)向光散射的能力增加或沒(méi)有變化。在細(xì)胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號(hào)均降低。因此可通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。

本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)。如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)，則必須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可以進(jìn)行檢測(cè)。

本試劑盒足夠檢測(cè)50個(gè)樣品，每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為10-100萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

1）本試劑盒需要使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。需自備PBS和70%乙醇。

2）細(xì)胞處理需輕柔，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

3）為防止不同批次細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)時(shí)所處周期不同導(dǎo)致重復(fù)性差，可以在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)胞的同步化處理。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，貼壁細(xì)胞一般在50～80%匯合度時(shí)收集為宜。

4）400目篩網(wǎng)過(guò)濾是用來(lái)將粘在一起的細(xì)胞團(tuán)濾掉，留下單細(xì)胞，否則會(huì)出現(xiàn)人為的多倍體干擾。如果沒(méi)有條件過(guò)濾，請(qǐng)?jiān)谌旧皩⒓?xì)胞輕彈以分散，再進(jìn)行染色。

5）熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，保存和使用過(guò)程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6）碘化丙啶對(duì)人體有刺激性，操作碘化丙啶時(shí)，應(yīng)注意防護(hù)，保護(hù)眼睛、避免吸入。

7）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品組成：

使用方法：

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：細(xì)胞數(shù)量控制在1×105~1 × 106個(gè)。

a）貼壁細(xì)胞：小心吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，用1 mL預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞。

b）懸浮細(xì)胞：1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心收集細(xì)胞。

c）組織細(xì)胞：將組織塊用剪刀剪成盡量小的小塊后，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h，經(jīng)過(guò)200-400目篩網(wǎng)過(guò)濾得到單細(xì)胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞。加入約1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。如組織難以消化，可加入適量膠原酶。

2. 細(xì)胞固定：

細(xì)胞沉淀用1 mL預(yù)冷的70%乙醇輕輕混勻，4℃固定2 h以上或者過(guò)夜。然后1000 g左右離心5 min沉淀細(xì)胞后，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的70%乙醇，以避免吸走細(xì)胞。

加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸。然后再次1000g離心5 min沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

3. 碘化丙啶染色液的配制：

對(duì)于1個(gè)樣品，在0.5 mL染色緩沖液中加入25uL 碘化丙啶儲(chǔ)液和10uL RNase A溶液，混勻待用。其它數(shù)量的樣品參考下表，根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液：

注：配制好的碘化丙啶染色液短時(shí)間內(nèi)可以4℃保存，宜當(dāng)日使用。

4. 染色：

每管細(xì)胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，輕輕混勻重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光孵育30分鐘，就可以進(jìn)行流式檢測(cè)，流式檢測(cè)最hao在5h內(nèi)完成。

5. 流式檢測(cè)和分析：

用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。