Glutathione Beads 4FF（GST填料）

產(chǎn)品貨號(hào)：G10510

產(chǎn)品說(shuō)明

Glutathione Beads 4FF可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的gu胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、gu胱甘肽依賴性蛋白和gu胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的重組衍生物。 Glutathione Beads 4FF是以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過12個(gè)原子的間隔臂，用化學(xué)方法共價(jià)結(jié)合了還原型gu胱甘肽制作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐壓的基質(zhì)，可以在相對(duì)較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化，更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化。

表 1 Glutathione Beads 4FF 產(chǎn)品性能

純化流程

1. 緩沖液的準(zhǔn)備

緩沖液在使用前最好用0.22um或者0.45um濾膜過濾。

平衡/洗雜液：140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4

洗脫液：用平衡液配制10mM還原型gu胱甘肽（現(xiàn)配現(xiàn)用）

注意：平衡液和洗脫液中可加入1-10 mM DTT

2. 樣品準(zhǔn)備

樣品在上樣前建議離心或用0.22um或0.45um濾膜過濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

2.1細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說(shuō)明，加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7000 rpm（7500xg）,離心15 min收集菌體，然后按照菌體：平衡液=1： 10（W/V）加入平衡液，加入終濃度為1 mM的PMSF。加入rong菌酶（工作濃度為0.2-0.4 mg/ml,如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加rong菌酶，同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，

但不能影響目的蛋白與填料的結(jié)合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來(lái)，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I）,混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10000 rpm（15000xg）, 4°C離心20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

2.2酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1） 將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5000 rpm（3800xg）,離心10 min,收集菌體得上清，即可直接加入柱子使用。

2） 對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用平衡液透析后才能加入柱子。

3. 層析柱的裝填

3.1重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將Glutathione Beads 4FF混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護(hù)液。

3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，2-8°C保存。

3.2中壓層析柱的裝填

裝柱前根據(jù)層析柱直徑計(jì)算柱子底面積，根據(jù)所需裝柱高度計(jì)算所需介質(zhì)體積，公式如下：

V = 1.15πr2h  (V：所需介質(zhì)體積ml；1.15：壓縮系數(shù)；r：柱管半徑cm；h：裝填高度cm）

注意：所取懸液體積應(yīng)為介質(zhì)體積的兩倍，因?yàn)榻橘|(zhì)體積只占懸液總體積的一半，另一半為保護(hù)液。

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無(wú)氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留1-2 cm的去離子水。

2）將介質(zhì)懸浮起來(lái)，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3）如果使用儲(chǔ)液器，應(yīng)立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4）打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對(duì)所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(gè)很好的裝填效果。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6）如果使用儲(chǔ)液器，去除儲(chǔ)液器，將分配器置于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。

8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

4. 樣品純化流程

4.1孵育法純化

1）根據(jù)純化樣品量，取適量Glutathione Beads 4FF加入離心管中，1000rpm離心1 min,吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。

2）向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的平衡液清洗介質(zhì)，1000rpm離心1 min,吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重復(fù)兩次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4°C振蕩孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。

4）孵育結(jié)束后，1000 rpm離心1 min,吸棄上清，或過濾收集介質(zhì)，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5）用5倍介質(zhì)體積的洗雜液清洗介質(zhì)，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質(zhì)），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。

6）加入3-5倍柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，室溫孵育10-15 min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次。

4.2重力柱法純化

1）將裝填好的Glutathione Beads 4FF重力柱用5倍柱體積平衡液進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù)2-3次。

2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時(shí)間至少2 min,保證樣品和介質(zhì)充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3）用10-15倍柱體積的洗雜液進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫，分段收集，每一個(gè)柱體積收集一管，分別檢測(cè)，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得 到高純度和高濃度的蛋白。

4.3中壓層析柱法純化

Glutathione Beads 4FF裝填好后，可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1）將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2）用3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲(chǔ)存緩沖液。

3）使用至少5倍柱床體積的平衡液平衡色譜柱。

4）利用泵或樣品環(huán)上樣。

注:樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會(huì)導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進(jìn)樣器更難使用。

5）用洗雜液沖洗柱子，直到紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個(gè)柱體積）。

6）使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

上述步驟洗脫結(jié)束后，用平衡液沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用保護(hù)液沖洗2個(gè)柱體積，然后將介質(zhì)置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 檢測(cè)

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

6. 填料清洗

GST標(biāo)簽蛋白純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無(wú)需再生，但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和結(jié)合載量性能下降, 這時(shí)需要對(duì)填料進(jìn)行清洗。

去除一些沉淀或變性物質(zhì)，建議使用下面的方法

用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)

用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗。